Exploring the fine composition of Camelus milk from Kazakhstan with emphasis on protein components

Mlle. Alma RYSKALIYEVA (2018)
Thèse doctorale, AgroParisTech - Paris (France)
School of Agriculture, Food, Biology, Environment and Health of the Agricultural, Veterinary and Forest Institute of France; 137p

Résumé

La présente étude visait à identifier, en explorant la fraction protéique des laits de camélidés provenant de plusieurs régions du Kazakhstan, des molécules originales (peptides, protéines) potentiellement responsables des propriétés attribuées au lait de chamelle. Nous avons d'abord analysé globalement la composition de la fraction protéique des laits (approche protéomique), en nous concentrant principalement sur les caséines et leur diversité moléculaire. S’agissant des protéines du lactosérum, nous avons concentré nos efforts sur la WAP dont les propriétés « inhibiteur de protéase » sont bien établies et qui est une originalité des camélidés (seul gros mammifère avec le porc exprimant cette protéine dans le lait). Enfin, nous avons commencé à isoler des vésicules extracellulaires du lait, qui sont connus pour porter des informations génétiques (ARNm et microARN) et des protéines impliquées dans la communication entre les cellules et les organismes, afin de caractériser leur protéome.
Près de 180 échantillons de lait de 2 espèces de camélidés (Camelus bactrianus, C. dromedarius et leurs hybrides) ont été collectés à différents stades de lactation, âge et nombre de vêlages, et soumis à différentes techniques analytiques et approches protéomiques (SDS-PAGE, LC-MS/MS et LC-ESI-MS). Cinquante molécules protéiques correspondant à des variants génétiques, des isoformes issues de modifications post-traductionnelles et d'épissages différentiels, appartenant à 9 familles de protéines (?-, ?s1-, ?s2-, ?- et ?-CN, WAP, ?-LAC, PGRP, CSA / LPO) ont été caractérisées. L’existence de deux isoformes inconnues (i1 et i2) de la caséine ?s2 a été observée dans les deux esèces. Ces isoformes sont des variants d'épissage consécutif pour l’un à l’intégration d'une séquence de 27 nucléotides « in frame », codant pour le nonapeptide ENSKKTVDM, dont la présence a été confirmée au niveau génomique, flanquée de motifs canoniques définissant une structure exonique. La seconde isoforme, présente à différents niveaux de phosphorylation compris entre 8P et 12P, comporte un décapeptide supplémentaire (VKAYQIIPNL), révélé par LC-MS/MS, codé par une extension 3 'de l'exon 16. En outre, nous rapportons, pour la première fois à notre connaissance, l’existence d'une isoforme de phosphorylation de la caséine ?s2 présentant au moins un résidu S/T phosphorylé n’appartenant pas à la séquence canonique habituelle (S/T-X-A) reconnue par la kinase mammaire, suggérant ainsi l'existence de deux systèmes impliqués dans la phosphorylation des caséines, dans la glande mammaire.
Cette étude visait également à évaluer les différences entre espèces. Nous avons démontré que les variants génétiques, qui jusqu'ici semblaient être spécifiques d'espèce (?-CN A pour Bactrian et ?-CN B pour dromadaire), sont présents chez C. dromedarius et C. bactrianus. En ce qui concerne la caséine ?, nous avons également pu identifier dans les deux variants génétiques (A et B) une isoforme courte (946 Da plus légère que la caséine ?) résultant très probablement d’une protéolyse par la plasmine.
S’agissant de la WAP, nous avons identifié chez C. bactrianus un nouveau variant génétique (B), issue d'une transition G => A conduisant à un changement de codon (GTG/ATG) dans la séquence nucléotidique de l’ARNm, qui entraine un changement d’acide aminé en position 12 de la protéine mature (V12M). Un variant résultant de l’usage du site d'épissage canonique, reconnu comme tel chez les autres mammifères exprimant la WAP dans leur lait, a été identifié. La forme majoritaire de la WAP cameline, décrite pour la première fois par Beg et al. (1986) qui présente une insertion de 4 résidus d'acides aminés (56VSSP59) dans le segment peptidique reliant les deux domaines 4-DSC, résulte de l'utilisation d'un site d'épissage cryptique intronique improbable, prolongeant l'exon 3 du gène de 12 nucléotides sur son extrémité 5 '. De plus, nous confirmons que chez les camélidés, l'intron 3 du gène spécifiant la WAP, est un intron rare de type GC-AG, avec un site donneur faible qui s’accompagne d’un effet compensatoire au site consensus de l'exon accepteur.
Finalement, en utilisant un protocole optimisé, nous avons isolé les vésicules extracellulaires dérivés du lait de camélidés présentant les caractéristiques morphologiques, de taille et de contenu en protéines des exosomes. Nous avons identifié un millier de protéines différentes représentant le premier protéome des VE dérivés du lait de chamelle qui semble plus étendu que le protéome du lait de chamelle, incluant notamment les marqueurs associés aux VEs, tels CD63, CD81, HSP70, HSP90, TSG101 et ADAM10. Nous avons également identifié des protéines présentes dans d'autres compartiments du lait. C'est notamment le cas pour les protéines apparentées à Ras, MFG-E8, ou CD9 qui sont également présentes dans les globules gras du lait. Nos résultats suggèrent par ailleurs fortement que les VEs dérivés du lait de chamelle ont des origines cellulaires différentes.

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