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Exploring the fine composition of Camelus milk from Kazakhstan
with emphasis on protein components
Mlle. Alma
RYSKALIYEVA (2018)
Thèse doctorale, AgroParisTech - Paris (France)
School of Agriculture, Food, Biology, Environment and Health
of the Agricultural, Veterinary and Forest Institute of
France; 137p
 Résumé
La présente étude visait à identifier, en
explorant la fraction protéique des laits de camélidés provenant
de plusieurs régions du Kazakhstan, des molécules originales
(peptides, protéines) potentiellement responsables des
propriétés attribuées au lait de chamelle. Nous avons d'abord
analysé globalement la composition de la fraction protéique des
laits (approche protéomique), en nous concentrant principalement
sur les caséines et leur diversité moléculaire. S’agissant des
protéines du lactosérum, nous avons concentré nos efforts sur la
WAP dont les propriétés « inhibiteur de protéase » sont bien
établies et qui est une originalité des camélidés (seul gros
mammifère avec le porc exprimant cette protéine dans le lait).
Enfin, nous avons commencé à isoler des vésicules
extracellulaires du lait, qui sont connus pour porter des
informations génétiques (ARNm et microARN) et des protéines
impliquées dans la communication entre les cellules et les
organismes, afin de caractériser leur protéome.
Près de 180 échantillons de lait de 2 espèces de camélidés (Camelus
bactrianus, C. dromedarius et leurs hybrides) ont été
collectés à différents stades de lactation, âge et nombre de
vêlages, et soumis à différentes techniques analytiques et
approches protéomiques (SDS-PAGE, LC-MS/MS et LC-ESI-MS).
Cinquante molécules protéiques correspondant à des variants
génétiques, des isoformes issues de modifications
post-traductionnelles et d'épissages différentiels, appartenant
à 9 familles de protéines (?-, ?s1-, ?s2-,
?- et ?-CN, WAP, ?-LAC, PGRP, CSA / LPO) ont été caractérisées.
L’existence de deux isoformes inconnues (i1 et i2) de la caséine
?s2 a été observée dans les deux esèces. Ces isoformes sont des
variants d'épissage consécutif pour l’un à l’intégration d'une
séquence de 27 nucléotides « in frame », codant pour le
nonapeptide ENSKKTVDM, dont la présence a été confirmée au
niveau génomique, flanquée de motifs canoniques définissant une
structure exonique. La seconde isoforme, présente à différents
niveaux de phosphorylation compris entre 8P et 12P, comporte un
décapeptide supplémentaire (VKAYQIIPNL), révélé par LC-MS/MS,
codé par une extension 3 'de l'exon 16. En outre, nous
rapportons, pour la première fois à notre connaissance,
l’existence d'une isoforme de phosphorylation de la caséine ?s2
présentant au moins un résidu S/T phosphorylé n’appartenant pas
à la séquence canonique habituelle (S/T-X-A) reconnue par la
kinase mammaire, suggérant ainsi l'existence de deux systèmes
impliqués dans la phosphorylation des caséines, dans la glande
mammaire.
Cette étude visait également à évaluer les différences entre
espèces. Nous avons démontré que les variants génétiques, qui
jusqu'ici semblaient être spécifiques d'espèce (?-CN A pour
Bactrian et ?-CN B pour dromadaire), sont présents chez C.
dromedarius et C. bactrianus. En ce qui concerne la caséine ?,
nous avons également pu identifier dans les deux variants
génétiques (A et B) une isoforme courte (946 Da plus légère que
la caséine ?) résultant très probablement d’une protéolyse par
la plasmine.
S’agissant de la WAP, nous avons identifié chez C. bactrianus un
nouveau variant génétique (B), issue d'une transition G => A
conduisant à un changement de codon (GTG/ATG) dans la séquence
nucléotidique de l’ARNm, qui entraine un changement d’acide
aminé en position 12 de la protéine mature (V12M). Un variant
résultant de l’usage du site d'épissage canonique, reconnu comme
tel chez les autres mammifères exprimant la WAP dans leur lait,
a été identifié. La forme majoritaire de la WAP cameline,
décrite pour la première fois par Beg et al. (1986) qui présente
une insertion de 4 résidus d'acides aminés (56VSSP59) dans le
segment peptidique reliant les deux domaines 4-DSC, résulte de
l'utilisation d'un site d'épissage cryptique intronique
improbable, prolongeant l'exon 3 du gène de 12 nucléotides sur
son extrémité 5 '. De plus, nous confirmons que chez les
camélidés, l'intron 3 du gène spécifiant la WAP, est un intron
rare de type GC-AG, avec un site donneur faible qui s’accompagne
d’un effet compensatoire au site consensus de l'exon accepteur.
Finalement, en utilisant un protocole optimisé, nous avons isolé
les vésicules extracellulaires dérivés du lait de camélidés
présentant les caractéristiques morphologiques, de taille et de
contenu en protéines des exosomes. Nous avons identifié un
millier de protéines différentes représentant le premier
protéome des VE dérivés du lait de chamelle qui semble plus
étendu que le protéome du lait de chamelle, incluant notamment
les marqueurs associés aux VEs, tels CD63, CD81, HSP70, HSP90,
TSG101 et ADAM10. Nous avons également identifié des protéines
présentes dans d'autres compartiments du lait. C'est notamment
le cas pour les protéines apparentées à Ras, MFG-E8, ou CD9 qui
sont également présentes dans les globules gras du lait. Nos
résultats suggèrent par ailleurs fortement que les VEs dérivés
du lait de chamelle ont des origines cellulaires différentes.
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